宿主细胞在进化过程中已经具有防御机制（例如先天免疫）以消除病毒感染。然而病毒也已经进化出几种对抗策略，可从宿主防御机制中逃脱。许多研究表明IFN诱导蛋白ISG15和ISGylation在针对多种类型的RNA和DNA病毒的抗病毒活性中起着重要作用，然而也有相互矛盾的结果。今天为大家推荐一篇由日本神户大学医学研究生院研究团队发表在Journalofvirology上的文章，标题为ISGylationofHepatitisCVirusNS5AProteinPromotesViralRNAReplicationviaRecruitmentofCyclophilinA。丙型肝炎病毒（HCV）感染是慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌的主要原因，病毒RNA的复制发生在源自内质网（ER）的双膜囊泡上，并且需要细胞宿主因子的参与，本文结果表明NS5A可以经过ISGylation*募集CypA促进HCV复制。
首先作者通过免疫共沉淀以及免疫印迹确定HCVNS5A是ISGylation的目标底物，然而ISGylation过程中TRIM25、HHARI以及HERC5均可作为E3连接酶，用于ISGylation不同的底物。为了研究E3连接酶在NS5AISGylation中的特异性，作者将三种E3连接酶分别于底物结合，通过免疫印迹实验进一步确定HERC5是NS5AISGylation的特异性E3连接酶。为了确定HERC5连接酶的活性是否与NS5AISGylation有关，作者使用HERC5的无催化活性的CA突变体（对NS5A蛋白进行了ISGylation分析。结果显示：野生型（WT）HERC5可诱导了NS5AISGylation，而突变体HERC5诱导NS5AISGylation显著降低，表明需要HERC5连接酶的活性对NS5AISGylation是非常重要的。
接下来作者想鉴定NS5A蛋白上的ISGylation位点。已有文献报道ISG15通过Lys进行偶联，作者团队构建了一系列NS5A突变体，结合免疫共沉淀实验，结果表明ISG15在NS5A蛋白的K44，K68，K，K和K发生ISGylation。为了确定在HCVRNA复制中NS5A上的Lys的关键位点，通过荧光素酶报告系统等实验，最终结果表明K的NS5AISGylation参与HCVRNA复制的正调控。
最后作者研究了NS5AISGylation如何参与HCVRNA复制的正调控，。根据有关报道亲环蛋白A（CypA）可能通过与NS5A域II（DII）的关联而参与HCVRNA复制的正调控，作者通过应用CsA处理发现可抑制NS5A与CypA的缔合，并且FLAGISG15-AA突变体、HA-NS5AKR突变体、以及其野生型进行免疫沉淀实验，结果表明NS5AISGylation增强了NS5A与CypA的关联。
在本研究中，作者阐明了NS5AISGylation在HCVRNA复制中的作用。确定了NS5A蛋白特定Lys残基上的ISG15整合位点，进一步通过突变体对病毒复制的影响验证了本试验的结论。结果表明，NS5AISGylation通过增强NS5A与HCVRNA复制的关键宿主因子（CypA）的缔合而参与了HCVRNA复制的正向调节。靶向ISGylation的机制可能是今后开发用于治疗慢性HCV感染的下一代疗法
ISG15通过三种赖氨酸（E1活化酶（UBE1L），E2缀合酶（UbcH8）和E3连接酶（HERC5））通过特定的赖氨酸（Lys）残基共价结合到目标底物蛋白上。该过程称为“ISGylation”，
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